神经再生新突破：我们离逆转瘫痪更近一步？

包括我们人类在内的哺乳动物，其神经系统都可分为两大部分：中枢神经系统和外周神经系统。中枢神经系统由脑和脊髓组成，它们是“中枢”，所以负责指挥和控制身体；而外周神经系统由从脑和脊髓发出的神经组成，这些神经就像通信线缆，负责从大脑和脊髓发送至身体各部分的信息传递。

但是，这两大系统的修复能力大相径庭：外周神经系统损伤后拥有一定的再生能力，而中枢神经系统损伤后，其轴突几乎不能再生，这往往会导致永久性功能缺陷。而促进损伤后的中枢神经再生、功能恢复也很困难，这就像电脑，如果只是外部设备损坏，维修起来相对容易；但如果主板出现问题，维修起来就麻烦多了。所以，促进损伤后的中枢神经轴突再生和功能恢复，一直是科学家们的一个梦想。

不过就在最近，瑞士洛桑联邦理工学院的马克·安德森（Mark A. Anderson）研究团队找到了控制后肢行走的关键神经元，并让脊髓全横断的小鼠成功恢复了行走功能^[1]。这相当于在电脑主板完全损坏后，成功维修并恢复正常使用。这项令人兴奋的研究于近期发表在《科学》杂志上。

其实在5年前，同一研究团队就曾在《自然》上发表过论文。当时，他们通过AAV介导多种营养因子和细胞外吸引性分子表达，结合水凝胶技术，已经在小鼠身上取得了部分的成功：促使小鼠受损脊髓发生了再生，并在脊髓损伤远端检测到了电信号的传导。但遗憾的是，小鼠的行走能力并未恢复^[2]。

所以，我们不禁要问：5年前，该团队的技术为何未能实现行走功能的恢复？他们的最新研究成果有何突破性进展？而更重要的一个问题是：现在的研究成果，距离实际造福脊髓损伤患者还有多远？

这次，他们做了什么

如前所述，促进中枢神经元损伤后的轴突再生并不容易，现在的方法主要分为以下几种^[3]：

1. 减少细胞外抑制分子的存在，增加吸引性分子的存在；
2. 激活神经元自身轴突再生的能力；
3. 在损伤处移植干细胞团块或生物材料，促进损伤后的轴突跨越损伤处。

尽管这些或间接、或直接的方法，是可以促进轴突的再生，甚至可以产生电信号的传递，但我们还是没找到一种方法，能够完全恢复神经功能。

以往的脊髓损伤再生研究显示，动物和人的脊髓不完全损伤后，可以在后期恢复部分功能，包括行走能力。但是，在脊髓全损伤的情况下，行走能力不能恢复。之所以不完全损伤的脊髓可以恢复部分功能，是因为脊髓的上节段神经元会投射到下节段神经元，在脊髓半横断后，未损伤侧的轴突会绕过损伤处，支配损伤远端的神经元^[4]。这就好像公路的部分车道受损，车辆仍然可以通过其他车道绕过损坏的路段，继续到达目的地。

因此，以往对脊髓全损伤后再生的研究，确实可以促进轴突的再生，但还无法实现功能恢复。在这个背景下，研究人员提出了系列假设和追问：既然单纯使神经元轴突穿过损伤区向损伤远端生长并不能实现功能的恢复，那么使其达到自然靶标（自然的神经肌肉连接）是功能恢复的关键吗？如果答案是肯定的，那么哪些神经元再生出轴突并与靶标形成连接是实现行走功能的必要条件呢？是否可以寻找出再生后易投射自然靶标的神经元亚群，对其轴突趋化吸引并引导至其自然靶标区域，来重建环路呢？ 

确定了整个思路后，研究人员对位于胸段的神经元在时间和空间上进行了标记和区分，这些神经元发出下行轴突到腰段，并支配行走。他们使用投射特异性和单细胞RNA测序技术，确定了与功能恢复密切相关的神经元亚群的身份。这个亚群中的神经元表达了VsX2，Hoa7和zfhx3，可以称为SC^{Vsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar}。通过对SC^{Vsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar}进行连接组学分析，研究人员确定其为位于胸段、接受上级轴突输入、对腰段有投射的神经元。

于是，研究人员在损伤上游表达多种营养因子和细胞外基质分子，用一种“推”的力量，直接促进SC^{Vsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar}神经元生长；除了“推”，还有“拉”，研究人员在损伤处放置含有多种营养因子的水凝胶、在损伤远端表达吸引性分子，SC^{Vsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar}在“推拉力”的双重作用下，穿过损伤区，最终与腰段神经元形成连接。

在白喉毒素杀死Vsx2神经元以及化学遗传失活VsX2神经元后，小鼠又恢复了瘫痪，这说明该群神经元对于后肢行走功能的恢复是必要的。

瞭望未来

这项研究的创新之处，在于研究人员发现了脊髓损伤后，特定类型的神经元再生出轴突穿过损伤区与自然靶标形成连接是恢复行走的必要条件。作者结合现有的轴突再生技术和单细胞测序技术，表征了这一类型神经元的表达谱和连接谱。

对比该研究团队与5年前发表的成果，两篇文章促进损伤后再生的技术主要区别是，新研究找到并激活具有投射到目的靶标区域的神经元亚群。此外，新研究同时在损伤远端表达了促进轴突生长的营养因子，在“推力”之外，加上了“拉力”，并给予动物更长的恢复时间（4周vs.8周）。

这项研究给神经再生领域带来了巨大的希望，并提供了新的研究思路。除了这项研究优化延用的曾在五年前发表的多因子诱导轴突再生技术，新研究还证实了环路重塑的必要性，并发现了一种能发生自然投射的神经元亚群SC^{Vsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar}，结合改进后的治疗方式，使脊髓完全损伤的小鼠运动功能恢复到不完全脊髓损伤小鼠的水平。

在这项研究的基础上，我们迫切期待回答和验证新的问题，例如：灵长类动物是否存在相似的神经细胞亚群？此类亚群的存在在进化上有无潜在意义？是否能为哺乳动物中枢神经损伤难以再生提供新的解释和解题思路？就治疗而言，不同亚群之间能否相互转化？如何进行诱导转化？转化后的神经细胞亚群是否仍然可以具有连接到自然靶标区域的能力？转化或激活后能否实现更高水平的再生？

然而，现在的科学技术成果要应用于临床，还有较长的路要走。该研究在动物模型上实现的功能再生，不仅需要损伤上游细胞表达多种营养因子和细胞外基质分子，还需要在损伤处放置含有多种营养因子的水凝胶，同时在损伤远端表达吸引性分子。如果要在临床上复现这些手段，不光手术会带来巨大的创伤，多种因子的联合使用也会导致更严重的副作用，成本更是昂贵。另外，四肢行走的小鼠因脊髓半自主环路等原因，本就比人易于再生与实现功能的恢复。因此，在小鼠上取得的成果在灵长类乃至人上是否具有相同的疗效，仍需要经过更多实验的验证。

除此以外，其它实现长距离再生和功能恢复的研究，也值得结合该篇文章研究成果进行进一步关注与思考。就实现长距离再生来说，2018年，我国科学家在猴子身上通过外源植入NT3-壳聚糖材料，也实现了猴子脊髓损伤后数厘米的增长以及行走能力的部分恢复^[5]。我国科学家采用的方法，就像在公路出现坍塌后，人为地在坍塌处搭建了桥梁，因此车辆可以通过桥梁继续前进。

而对于实现功能恢复上，格雷瓜尔·库蒂纳（Gregoire Courtine）团队最早与2018年通过电刺激疗法实现三位脊髓损伤患者恢复了腿部肌肉控制^[6]，后续，该研究团队也把对脊髓损伤后恢复行走能力十分重要的神经元亚群进行了分类，在建立的小鼠模型上，复制了人类电刺激诱导的神经康复的关键特征，鉴定出了一类特定的兴奋性神经元^{[7]，[8]，[9]}，这些研究中对于不同再生能力神经元亚群的分类与讨论，也有望帮助人们综合分析并进一步理解，该如何对电刺激或其他方法（如pten等敲降）促进的轴突再生与功能恢复做出解释。

总而言之，结合不同的促进再生的手段，数管齐下是目前应用于轴突损伤后再生的主流研究手段。营养因子和细胞外粘附性分子等对损伤后的轴突都有促生长的作用，但是之前的实验结果都很难达到人们的预期。归咎其因，主要是营养因子半衰期短，很难达到损伤位点，剂量不足等等。

冉冉升起的基因疗法和细胞疗法给轴突损伤再生领域带来了新的希望。基因疗法一次注射持续有效，细胞治疗则可直接补充损失的细胞并为其生长提供适宜的环境，结合已有的生物材料与电刺激疗法，相信在不久的将来，技术的发展将带给我们期盼的结果，实现神经再生的终极梦想。

参考文献

[1]Squair, J. W. et al. Recovery of walking after paralysis by regenerating characterized neurons to their natural target region. Science 381, 1338-1345, doi:10.1126/science.adi6412 (2023).

[2]Anderson, M. A. et al. Required growth facilitators propel axon regeneration across complete spinal cord injury. Nature 561, 396-400, doi:10.1038/s41586-018-0467-6 (2018).

[3]Winter, C. C., He, Z. & Jacobi, A. Axon Regeneration: A Subcellular Extension in Multiple Dimensions. Cold Spring Harbor perspectives in biology 14, doi:10.1101/cshperspect.a040923 (2022).

[4]Sofroniew, M. V. Dissecting spinal cord regeneration. Nature 557, 343-350, doi:10.1038/s41586-018-0068-4 (2018).

[5]Rao, J.-S. et al. NT3-chitosan enables de novo regeneration and functional recovery in monkeys after spinal cord injury. Proceedings of the National Academy of Sciences 115, doi:10.1073/pnas.1804735115 (2018).

[6]Formento E, Minassian K, Wagner F, Mignardot JB, Le Goff-Mignardot CG, Rowald A, Bloch J, Micera S, Capogrosso M, Courtine G. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nat Neurosci. 2018 Dec;21(12):1728-1741. doi: 10.1038/s41593-018-0262-6. 

[7]Lewis D. Electrical stimulation helps paralysed people walk again – and now we know why. Nature. 2022 Nov;611(7936):438. doi: 10.1038/d41586-022-03605-8. 

[8]Kathe C, Skinnider MA, Hutson TH, Regazzi N, Gautier M, Demesmaeker R, Komi S, Ceto S, James ND, Cho N, Baud L, Galan K, Matson KJE, Rowald A, Kim K, Wang R, Minassian K, Prior JO, Asboth L, Barraud Q, Lacour SP, Levine AJ, Wagner F, Bloch J, Squair JW, Courtine G. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 2022 Nov;611(7936):540-547. doi: 10.1038/s41586-022-05385-7.

[9]Matson KJE, Russ DE, Kathe C, Hua I, Maric D, Ding Y, Krynitsky J, Pursley R, Sathyamurthy A, Squair JW, Levi BP, Courtine G, Levine AJ. Single cell atlas of spinal cord injury in mice reveals a pro-regenerative signature in spinocerebellar neurons. Nat Commun. 2022 Sep 26;13(1):5628. doi: 10.1038/s41467-022-33184-1.