早在2014年，《自然》杂志就已统计过史上被引次数最多的100篇论文，他们发现最知名的一些研究并未入选，例如发现高温超导体和DNA双螺旋结构解析等获得诺奖的研究。相反，上榜论文多是生物医学和统计学领域中实用性极强的技术方法，例如Lowry蛋白质测定法、Sanger测序法和PCR等。此外，像BLAST和Clustal这样的生物信息学工具、用于绘制进化树的邻接法、以及Kaplan–Meier和Cox模型等统计方法也位列其中。榜单还显示，计算机的发展推动了这些方法的普及，而工具类软件、数据库和统计模型往往能获得远超基础科学突破的引用量。

而在当前《自然》杂志更新的榜单中，排名有一半已经发生了变化，21世纪已有16篇论文跻身历史前50名。值得一提的是，微软研究人员在2015年人工智能会议上提交的一篇论文《用于图像识别的深度残差学习》，迅速攀升至历史百大榜单第5名（WoS、Dimensions和Scopus数据库排名中位数分析）。

进一步的分析发现，这篇论文已经成为21世纪以来被引用次数最多的论文。该论文的作者提出了深度残差学习（ResNet）架构，突破性地解决了深层神经网络训练中的信号衰减问题，使网络层数达到前所未有的深度，并在2015年赢得图像识别竞赛。ResNet不仅成为深度学习发展的重要里程碑，也为后续的AI突破——如AlphaGo、AlphaFold和ChatGPT等技术的出现奠定了基础。

不过，不同数据库对这篇论文的引用统计存在差异。谷歌学术将其列为第二高被引论文，引用次数达25.4万，而Web of Science则将其排在第三，引用略超10万。尽管排名不一，在五个主流数据库中，它的中位排名居首。然而，引用次数本身存在诸多不公平因素，例如发表时间较早、所处领域热门等都会带来积累优势。尽管《自然》曾尝试通过计量学方法调整这些影响，但由于入选文章本就引用极高，整体榜单变化不大，仅有部分疫情相关新论文有所上升。

除此之外，人工智能、研究软件与方法、癌症与健康相关研究也进入21世纪被引次数最高论文榜单。AI领域凭借跨学科适用性和迅猛发展势头，多篇关键论文高居榜单，包括2012年开启深度学习热潮的AlexNet、推动大语言模型发展的Transformer架构“Attention is all you need”，以及广泛应用于图像处理的U-Net网络等。开源特性和预印本文化也促进了这些论文的广泛传播。

研究软件方面，定量PCR、RNA测序分析工具DESeq2、结晶分析程序SHELX等被广泛引用。健康类论文中，GLOBOCAN癌症统计报告、癌症标志综述以及DSM-5精神障碍分类指南影响深远。此外，主题分析方法、PRISMA系统综述报告指南、I²统计量等研究质量提升工具也跻身前列，scikit-learn、lme4、G*Power等统计与编程软件的引用量也极高。

总的来看，许多论文因其快速发展趋势在引用上展现出天然优势，还有一些论文更是借助工具性、方法指南或综述性获得超高引用。然而，一个值得深思的问题也浮上水面：为什么原创性的基础研究逐渐淹没在高被引论文中？显而易见的是，引用次数已经不再能够完全评估科研质量及其影响力，或许我们是时候引入新的评价体系了。

21世纪十大高被引论文

01. Deep residual learning for image recognition
用于图像识别的深度残差学习

He, K., Zhang, X., Ren, S., & Sun, J.
发表日期：2016
引用次数：103,756–254,074

这篇论文提出了残差学习框架（ResNet），成功解决了深层神经网络训练困难的问题。通过引入“残差连接”，网络可以更高效地学习相对于输入的变化，使得深度高达152层的模型依然易于优化，并显著提升了图像识别准确率。这一突破奠定了深度学习在计算机视觉领域的关键基础。

02. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔC_T Method
使用实时定量PCR及2^-ΔΔC_T方法分析相对基因表达数据

Livak, K. J., & Schmittgen, T. D. 
发表日期：2001
引用次数：149,953–185,480

实时定量PCR数据常用的两种分析方法是绝对定量和相对定量，其中2^-ΔΔC_T方法是一种简便实用的相对定量工具。这篇论文介绍了该方法的原理、假设与应用，并补充了两种有助于分析的衍生变体。

03. Using thematic analysis in psychology
在心理学中使用主题分析法

Braun, V., & Clarke, V.
发表日期：2006
引用次数：100,327–230,391

这篇论文系统阐述了主题分析在心理学中的应用，强调其作为一种灵活且易于上手的定性研究方法的重要性。文章呼吁研究者更多关注和规范使用主题分析，认为它在心理学及其他领域的定性研究中具有广泛价值。

04. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, DSM-5
《精神障碍诊断与统计手册》第五版（DSM-5）

American Psychiatric Association
发表日期：2013
引用次数：98,312–367,800

《精神障碍诊断与统计手册》第五版（DSM-5）是当前全球最广泛使用的精神疾病诊断标准之一。它是对第四版（DSM-IV）及其修订版的全面更新，旨在反映过去十余年中精神病学、心理学、神经科学等领域的最新研究成果。

05. A short history of SHELX
SHELX简史

Sheldrick, G. M.
发表日期：2007
引用次数：76,523–99,470

这篇论文总结了SHELX晶体结构解析软件的发展历程，回顾了其从1976年版本到现代的演进。SHELX系列尽管起源于旧式计算环境，但凭借稳定性、实用性和不断改进，至今仍被广泛应用。

06. Random forests
随机森林

Breiman, L.
发表日期：2001
引用次数：31,809–146,508

这篇论文介绍了随机森林算法的原理与优势。随机森林通过构建多个相互独立、基于随机特征选择的决策树组成分类器，其泛化误差会随着树数量的增加而趋于稳定。该方法在误差率上优于Adaboost，具有更强的抗噪性，并能利用内部估计评估模型性能与变量重要性，广泛适用于分类与回归任务。

07. Attention is all you need
注意力机制即一切

Vaswani, A., Shazeer, N., Parmar, N., Uszkoreit, J., Jones, L., Gomez, A. N., … & Polosukhin, I. 
发表日期：2017
引用次数：56,201–150,832

这篇论文提出了一种全新的神经网络架构——Transformer，完全基于注意力机制，摒弃了以往依赖循环（RNN）或卷积（CNN）结构的复杂模型。Transformer结构简单、并行性强，训练效率显著提高。这一成果标志着注意力机制在序列建模中的巨大潜力。

08. ImageNet classification with deep convolutional neural networks
使用深度卷积神经网络进行ImageNet图像分类

Krizhevsky, A., Sutskever, I., & Hinton, G. E.
发表日期：2012/2017
引用次数：46,860–137,997

这篇论文介绍了深度卷积神经架构AlexNet网络在ImageNet图像分类任务中的应用。为了提高训练效率，作者采用了非饱和激活函数和GPU加速的卷积操作，并通过“dropout”技术有效减少过拟合。在ILSVRC 2012竞赛中，该模型变体以15.3%的Top-5错误率夺得第一名。这项工作开创了深度学习在图像识别领域的新时代。

09. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries
全球癌症统计2020：GLOBOCAN对185个国家36种癌症发病率和死亡率的估算

Sung, H., Ferlay, J., Siegel, R. L., Laversanne, M., Soerjomataram, I., Jemal, A., & Bray, F.
发表日期：2020
引用次数：75,634–99,390

这篇文章基于国际癌症研究机构（IARC）发布的 “GLOBOCAN 2020”数据，更新了全球癌症负担的最新情况。2020年，全球预计新增癌症病例达1930万例，死亡病例近1000万例。女性乳腺癌首次超过肺癌，成为全球最常见癌症，其次为肺癌、结直肠癌、前列腺癌和胃癌；而肺癌仍是癌症死亡的首要原因。预计到2040年，全球癌症新发病例将增至2,840万例，较2020年增长47%。

10. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries
全球癌症统计2018：GLOBOCAN对185个国家36种癌症发病率与死亡率的估算

Bray, F., Ferlay, J., Soerjomataram, I., Siegel, R. L., Torre, L. A., & Jemal, A. 
发表日期：2018
引用次数：66,844–93,433

这篇文章基于“GLOBOCAN 2018”数据，评估了全球癌症负担，并重点分析了全球20个地区的地理差异。2018年全球预计将有1810万新发癌症病例和960万癌症死亡，肺癌在发病率和死亡率中均居首位，但不同国家和地区最常见及致死率最高的癌症类型差异显著，受经济发展水平和生活方式影响明显。

小猕猴桃一直是一个对新鲜事物感到无比好奇的人。这天，它正在路上快乐的行走，而它的目光被一个金色的东西所吸引。“听说过这个金色的东西能给人带来无限的无可比拟的快乐。” 它望着那个金色犹豫了一会儿，决定离开。因为它听说过这个东西的阴暗面：一旦对它产生依赖，它将无法摆脱这个金色东西的诱惑。小猕猴桃继续往前走，可是金色的东西再次出现了。它心里想：或许一次，就体验那种令人疯狂的快乐一次，不会产生依赖吧？它犹豫着，最后决定吸食了这个金色的神奇东西……那种亢奋（euphoria）是它从来没体验过的。在这个金色的世界里，它意识到，这种快乐是任何美食，性和社会成就都比不上的。于是，它忍不住继续寻找这份快乐，以为可以填补生活带来的黑色空洞。

可是，小猕猴桃也意识到，这个金色东西带来的快乐逐渐变得短暂，而在快乐的过后，金色东西的戒断（withdrawal）让它陷入了更深的灰暗里。它渴望金色的世界，更害怕继续处于这种黑暗里，因此它发了疯似得继续寻找更多的金色东西，以来填补短暂的黑暗。在这个漩涡里，小猕猴桃越陷越深。它希望停下来，从生活点滴的美好中寻找快乐以弥补这些黑暗，可是它突然发现，生活中那些它曾经喜欢的东西早已贫乏无味。再次看到金色的东西时，它明确的知道，金色的东西已经无法给它提供快乐，反而会让它事后更加痛苦。但是它依然无法停止对它的渴望，吸食金色东西已经成为一种难以改变的习惯，而华丽的金色在它黑暗的世界里无比闪耀。

这段风靡网络的小猕猴桃视频，至今在Youtube上已有3000多万的观看量，成为了诠释万千药物成瘾故事的一个缩影。

药物成瘾是一种慢性的，具有复发性的行为紊乱。其特点为，在严重不良的后果下，仍强迫性地寻求并使用药物。成瘾性药物包括酒精，香烟里的尼古丁，毒品（如海洛因、可卡因）。根据世界卫生组织在2021年的统计，药物成瘾和滥用影响着大约四千万人口。每年大约六十万人死于药物成瘾带来的后果，而这其中甚至并不包括酒精摄取带来的社会危害。了解药物成瘾背后的机制和更容易受其影响的人群，可以帮助人们更早地介入并减少药物成瘾所带来的健康，心理以及社会危害。本文将从心理学和神经科学的角度，来解释药物使用如何一步步发展成药物成瘾，而一旦成瘾，又为何难以根治。

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这个岛和神户许多地方一样，在1995年的阪神淡路大地震中被夷为平地。那场地震里，5000余人死亡，超过10万栋建筑遭到破坏，这座岛是在后来才逐渐重建起来。随着列车向前驶去，摩天大楼逐渐进入视野。在城市四周可以看见赫然耸立的六甲山脉，还有从发电厂、炼钢厂和造船厂等许多细长烟囱里升起的滚滚黑烟。

如今，人工岛上不仅有神户港，还包含了酒店、医疗中心、大学、一个大型会议中心和宜家商店。此外，那里还有由政府出资的三个日本理化学研究所（RIKEN）研究机构：计算科学研究中心（到2011年为止，那里拥有着全球最快的超级计算机）、生命科学技术中心和发育与再生科学综合研究中心（CDB）。

在其中一间实验室的入口，贴着一张已经褪色的海报，被很窄的塑料边框包住，海报上方是星舰企业号的机组成员们，年轻的柯克舰长骄傲地坐在舰长椅上。下方则是广为人知的《星际迷航》台词：勇踏前人未索之境。

而在门的另一边，器官发育与神经发生实验室的科学家们则在试图解决多年来一直被科幻小说当作灵感的问题。这是一个十分前沿的新兴研究领域：用干细胞培育组织和器官，最终重建躯体。他们希望这可以为一系列衰老性疾病提供新一代治疗手段，并揭露大脑发育过程中的秘密。

眺望未知新大陆

在受精后不久的胚胎里，有着一团完全相同且未特化的细胞：它们被称作多能干细胞。它们既能一直保持在这种未特化状态，也可以随时分裂出子细胞，分化形成人体内任一类型的细胞。虽然研究者们从胚胎干细胞中，看到了医学治疗手段向前发展的希望；但是，由于这些细胞只能从人类胚胎里提取，使用这些细胞是否符合伦理，相关的质疑和讨论从未停止。

随后，在2007年，京都大学的山中伸弥小组发现，成年小鼠的结缔组织细胞能恢复到多能的干细胞样状态，再编程后可以转化成其他类型的细胞。其他研究者进一步发现，人体中几乎任意细胞都可以经过类似的再编程，分化为其他类型细胞。

2008年，美国研究者从一名82岁的肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS，一种运动神经元病）女性患者身上取得了皮肤细胞。细胞被放入培养皿后，对其进行再编程，分化成为运动神经元细胞，也就是被ALS损害的那群细胞。2010年，斯坦福大学的研究者发现，大鼠结缔组织细胞可以绕过多能状态，直接再编程形成神经元。

这些进展为人类胚胎干细胞的获得，提供了一个全新的、争议更少的方式。不管是研究疾病的分子学和细胞学机制，还是测试新研发药物的作用，研究者都可以自行在实验室里培养出干细胞，对它们进行再编程，生成研究所需的任意细胞。这也为再生医学的一个里程碑——首次成功移植完全由人造组织构成的器官——奠定了基础。

首位移植受者是安德马里亚姆·泰克莱森伯特·贝耶恩（Andemariam Teklesenbet Beyene），一名36岁的厄立特里亚人，在冰岛大学攻读地球物理学的硕士学位。在冰岛学习期间，贝耶恩被诊断出来患有晚期癌症，一个高尔夫球大小的肿瘤几乎堵住了他的气管。一开始，他拒绝接受这种开创性疗法，但在和冰岛的医生及家人商讨后，最终还是同意接受新型治疗。

这一新疗法需要分散在全球各地的三个团队共同协作完成。首先，他们对贝耶恩的气管进行CT三维成像，并将数据传送至伦敦大学学院。扫描结果被用来建了一个Y状玻璃模型，外面用纳米复合多聚体材料形成一个多孔的支架。这个支架随后被送到美国哈佛生物科学公司（Harvard Bioscience），他们将这个支架“种”在从贝耶恩体内提取出的干细胞中，然后在量身设计的生物反应器里孵育了几天；这一步骤能使细胞浸透到支架的小孔里，并分化形成结缔组织。最终，支架被送回斯德哥尔摩的卡罗林斯卡医学院。在那里，医护人员进行了一场长达12小时的移植手术。

保罗·马基亚里尼（Paolo Macchiarini）是卡罗林斯卡医学院的一名外科医生，他和同事们在2011年6月成功移植了首个人造气管。贝耶恩在手术后的数周内一直很虚弱，卧床不起。但最后他完全康复，并且八个月后顺利毕业。

这并非首例气管移植。但是，以前移植的气管都是从人体供者获取，从中剥离出软骨结构后、重新注入受者的干细胞。寻找合适供者常常需要数月的时间，而人工支架的使用则大大缩短了这段时间。这也拯救了贝耶恩的性命（人工气管还同时克服了其他障碍：由于贝耶恩的新气管完全由人工合成，被他的身体排斥的几率更小，所以他不需要像其他移植病人一样服用很强的免疫抑制药物，来防止排异发生）。

全球有上万人在等待器官移植，但并没有那么多器官足够所有人使用——2013年，英国的肾脏移植等待名单上有超过5600名患者，但最终只有3000多人得到了合适的肾源。全球供者短缺也变相刺激了牟利黑市的发展：从活体供者身上摘除的肾脏售价可以超过3万美元，而这些售价很快将会超过死亡供者所提供的。

“我们的最终目标是解决移植供体器官短缺的问题，并且提出疾病治疗的新方法，”安东尼·阿塔拉（Anthony Atala）说，他是美国北卡罗来纳州维克森林再生医学研究所的主任，“我认为这一领域将会不断发展，治疗手段也会随之进步，能治疗更多疾病。”

借助支架，阿塔拉和他的同事们已经用患者自己的细胞培育出了膀胱、尿道，以及最近刚研究成功的阴道。移植结果显示这些人造器官在移植数年后仍然安全有效。“我们正在进行一项临床试验，以评估用肌肉祖细胞治疗女性患者尿失禁的安全性，”阿塔拉说，“另外，我们还有很多研究结果还未到达临床试验的阶段。比如将皮肤细胞打印在烧伤部位上，以及针对肾脏疾病、囊性纤维病和血友病的细胞疗法。”

而在神户，器官发育与神经发生实验室正用另一种无需支架的方法来培育组织和器官。值得注意的是，他们已经发现胚胎干细胞可以自我排列。只要有合适的诱导条件，这些干细胞就能形成非常复杂的三维结构。通过一种特别研发的技术，这个团队已经诱导胚胎干细胞形成了部分垂体，甚至还有一小丁点大脑。而他们目前最主要的研究成果是，培育出有感光细胞和视网膜组织的部分胚眼。正是基于这项成果，研究员们希望发展出以干细胞为基础的全新疗法，来治疗多种致盲性疾病。

“我们并不确定接下来的研究方向，” 笹井芳树告诉我，当时他正担任着实验室主任和CDB副主任的职务，“我们确实站在最远的边界上，面对着一个未知的世界。”

注意大脑发育的细节

19世纪20年代早期，很多试验让我们得知了大脑发育早期的重要细节。

一个有机体在发育伊始，胚胎要首先经历一个叫做原肠胚形成的阶段。这个形成期会彻底改变胚胎的发育格局：先经过一系列的大规模细胞迁移，把原本由相同干细胞组成的中空球样胚胎，变成一个有着三层结构的实体形状，而这三层结构最终将形成人体的各个部位。刚开始，神经系统是最外层结构——也被称作外胚层——上的一段片状组织。这个薄片不断增厚、变大，然后进入了神经胚形成期，薄片内卷变成一个中空管，并从胚胎表面脱离，转而内陷于胚胎中。这个中空管最后会形成大脑和脊髓，而外胚层余下的部分将变成皮肤。

德国胚胎学家汉斯·施佩曼（Hans Spemann）从20世纪初开始研究胚胎发育。施佩曼喜欢亲手制作显微手术器材，也鼓励学生们这样做。他用从女儿头上拔下的一股头发，制成了一个细环。借助这个细环，他小心翼翼地把两栖动物的胚胎一分为二，发现只有包含了一小块组织的那一半胚胎才能继续发育成蝌蚪。而这一小块组织将会变成被称为施佩曼组织者（Spemann’s organiser）的结构，原肠胚形成期间所有的大规模迁移以及人类身体的形成都始于此处。

施佩曼还将蝾螈或者蜥蜴胚胎的组织移植到另外一个物种的胚胎里。由于移植的组织细胞在显微镜下不同于宿主细胞，他因此能够追踪到供体组织最终去了哪里。有一次，施佩曼把一个胚胎的组织者移植到了另外一个胚胎之后，发现它诱导了第二体轴的出现，甚至还有一个完整的第二神经系统结构。

当希尔德·普洛斯尔特（Hilde Proescholdt）作为博士生来到施佩曼实验室时，施佩曼让她赶紧深入研究这一问题。她照做了。通过用两种皮肤颜色不同的蝾螈再次试验，她确认了施佩曼组织者在移植后，可以诱发第二体轴的形成和神经系统——直接创造了同体双胞胎蝌蚪。值得注意的是，组成第二神经系统的细胞来源于受体组织，而不是供体。因此，施佩曼组织者用了某种方法，让附近的受体细胞形成了神经组织。

开始着手写这篇论文之后，普洛斯尔特嫁给了施佩曼实验室另一位成员，奥托·曼戈尔德（Otto Mangold）。没过多久，他们柏林家中的厨房煤气炉发生了爆炸，她死于严重烧伤。在她去世后，她的论文才发表出来。当时，胚胎学家们猜测施佩曼组织者分泌了一种可以诱导神经系统形成的蛋白。于是，他们决定着手识别这一蛋白。

研究持续了将近70年。在90年代早期，两组研究者识别出了施佩曼组织者分泌的两个蛋白，卵泡抑制蛋白（Follistatin）和头蛋白（Noggin）——后者的名字来源于英国俚语中的“头”。令人惊讶的是，这些蛋白并不诱导活动，相反，它们以“解除抑制”的方式进行间接操作：它们会拮抗另外一群蛋白，这群蛋白通常会抑制外胚层细胞向不成熟神经元的分化，反而诱导它们变成皮肤细胞。也就是说，这些外胚层细胞注定要变成神经元，除非卵泡抑制蛋白和头蛋白让它们分化成其他细胞。

“那段时间真是令人激动，”安德鲁·蓝斯顿（Andrew Lumsden）回忆道，他是伦敦英国医学研究理事会（MRC）发育神经生物学中心的创办者和上一届主任，“发育过程是通过阻止某些活动，而非增强这些活动来完成。这个想法非常创新，也给了所有人一个提醒。因为自从施佩曼和曼戈尔德的结果发表之后，所有人都在寻找神经系统的诱发物。”

那段时间，笹井芳树正在加利福尼亚大学爱德华·德·罗伯蒂（Edward De Robertis）实验室做博后工作。他在1986年于京都大学获得医学学位，随后成为一名内科住院医师。在此期间，他逐渐对大脑发育产生了兴趣。到达洛杉矶几个月后，笹井芳树分离出了编码脊索蛋白（chordin）的基因，它所编码的这一蛋白也能诱导神经组织的发生。笹井后来证明，脊索蛋白的作用机制是阻断对诱导干细胞向皮肤细胞分化的信号。

从那时起，全球各地的研究团队识别出了大脑发育过程中的许多分子和机制。现在我们知道，许多基因都参与了神经系统的分化，确保在发展过程中能在正确的地方生成正确的神经细胞；除此之外，我们还知道有许多基因都在引导不成熟神经元（和它们随后伸展出的纤维分支）转移到合适的终点。

这套知识构成了笹井的研究基础。原本只是对大脑发育过程的探索，却在不经意间发展出了在实验室里培育复杂组织的可能有效的方法。反过来，这也可能帮助我们揭开有关形态发生（morphogenesis）的某些谜底。在这个过程里，一片扁平的组织最终能变成一个有着高度复杂皮层的完整大脑。

细胞漂浮簇集

我在2014年1月下旬来到了CDB，笹井当时十分抢手：他的同事们刚刚发表了一项有关干细胞的重大发现，笹井也参与了其中一小部分。几家日本电视台的采访团队正站在CDB门口，希望能采访到笹井芳树。

《星际迷航》海报的楼上是一间会议室，里面有个大会议桌和一块竖立的白板。书籍和科技期刊占据了整整两面墙。房间的一扇门背后就是笹井的办公室，我看着两名行政助理匆忙地进进出出。另一扇门后面是实验室的主要区域，里面既有堆着试剂瓶的架子，也有塞满了离心机、一次性洗液头盒子、乳胶手套的实验台，本来很大的实验室被它们分隔成了许多小空间。我坐在会议桌后等待着笹井。

走廊两边还有些其他房间，拖鞋在门口整齐摆放成好几排。这些房间里面放置着更加专业的实验器材。其中一个是配备了微观悬臂的原子力显微镜，笹井和同事们用它来测量参与形态发生的微小机械力。另一个房间里放着一台转盘式孵育共聚焦显微镜，小组成员可以用它拍摄他们的人造组织弯曲和伸展时的状态。*

*译者注：共聚焦显微镜利用逐点照明和空间针孔调制，去除样品非焦点平面的散射光，相比于传统显微镜可以提高光学分辨率和视觉对比度；转盘装置则能实现快速图像采集，拍摄出样品的实时状态。

比起皮肤或者结缔组织，这些复杂组织培养起来更具有挑战性。笹井和同事们发明了一种新的方法，让胚胎干细胞在3D状态下生长并维持——也就是让它们悬浮在培养基中接受滋养，而不是平整地放在培养皿表面。他们发现，以这种方式生长的胚胎干细胞可以自发地排列，形成一些复杂组织，比如眼球、腺体和脑组织。

笹井回到京都成立了自己的实验室之后，在2000年想出了这个方法。随着对大脑发育的兴趣不断增长，他和同事发明了一套培养细胞的方法，以将小鼠胚胎干细胞转化成不同种类的神经元。一开始，他们尝试着在培养皿里的“饲养”细胞（feeder cells）一旁培育干细胞。饲养细胞可以分泌干细胞成熟所需的信号，让它们脱离胚胎状态并分化为成熟神经元。

然而，这个方法不太有效，只有一小部分干细胞能成为成熟神经元。因此，笹井怀疑发育和干细胞培养环境有关。从1887年开始，培养皿在全球被广泛应用于细菌和其他细胞的生长，但是它又平又浅，而真正的生命都发生在立体空间中。笹井推测，培养皿限制了干细胞，干扰了发育机制不让其生长。随后，他开始着手于设计一个“漂浮的”细胞培养系统。

一开始，他在96孔板里培养小鼠胚胎干细胞。这个孔板一般用来储存少量液体和组织样品。笹井团队起初很难让细胞成团。“我们和一家公司进行合作，通过优化孔板结构，来让细胞成团，”他谦虚地告诉我——并未提及在完善这一培养方法过程中所遇到的极大挑战。当初其他研究者绞尽脑汁也没能成功。笹井团队还放弃了标准的细胞培养基。一般来说，这些培养基里包含了好几种生长因子和信号分子（包括一些不明分子）。他们选择转而使用自己调制出的混合物。

团队用了五年时间来研发技术。到2005年，这项技术终于成熟了。在他们的特定培养基里，3000个干细胞可以成功簇集在一起，形成一个叫做胚状体样结合（embryoid body-like aggregates）的球形结构。由于这些细胞之间紧密地结合在一起，它们几乎可以像在真正的胚胎里一样互相交流。更重要的是，外胚层在默认情况下会形成神经组织，所以这些胚状体迅速富集了一堆不成熟神经元。用笹井技术培养出的胚胎干细胞，比起普通培养基，能够更高效地产生成熟神经元。团队还证明这种技术也能应用于诱导胚胎干细胞分化成不同种类的神经元，包括产生神经递质多巴胺（多巴胺在帕金森病里明显退化）的中脑神经元和小脑的浦肯野细胞（Purkinje cells ）（在一些运动性疾病中会彻底消失）。

“在子宫里，胚胎是立体发育的，” 笹井解释道，“所以使用我们的培养技术，胚胎干细胞可以更顺利地模仿自然发育。”不仅摆脱了普通培养皿的限制，培养基里还有合适的信号分子组合，胚状体样结合终于开始发育。

有了他们最初研究成果的铺垫，笹井的团队还发现，以这种方式培养的胚胎干细胞可以自发排列组成层状结构。这种结构类似于15天大小的小鼠大脑皮层。大脑皮层由六个不同层面组成，每一层有着以特定方式组合的特定类型细胞。在早期发育的阶段，未成熟神经元一波又一波地在胚脑里移行，于是由内往外形成了一个又一个的层面。3D培养基里的胚胎干细胞可以自己模仿这些移动，形成了在正确位置有正确细胞的层状结构。在这个迄今为止其他人都失败了的领域，他们取得了成功：在实验室里培育出一个大脑，或者至少是一部分。

笹井到达采访时，他看起来冷静、寡言，显然没有因为走廊外面喧闹的媒体而慌乱。他坐在我旁边的桌子前，助手为我们端来了绿茶。我问起那张《星际迷航》海报。他说，他并不是什么超级粉丝，只是认为那张海报很适合，因为他也不知道这些人造器官的发展方向。

向大规模培育进发

脑组织是这个团队所创造出复杂度最低的结构。对培养环境稍做改变之后，他们开始仿造其他复杂的器官。

笹井把外胚层细胞放在悬浮培养液中生长数日后，细胞开始自发改变形态。一开始它们向外突出，然后稍微内陷，形成一个类似胚眼的杯样结构，里面含有未成熟的视网膜细胞。当这个组织被切下来、单独培养两周以后，它发育成了一个有着六层结构的视网膜，类似于一个8天大小的小鼠眼睛。

2011年笹井团队报道，他们已经利用细胞培养系统成功培育出了部分脑垂体。脑垂体常被称作“主腺体”（the master gland），因为它控制着激素的生成，而这些激素会控制其他腺体。两个不同部位的胚胎组织互相作用，形成了笹井团队的人造垂体；它们的同时存在导致了一部分外胚层自我折叠，并从主体分离，形成一个小囊袋。囊袋里的细胞继续变化，产生了成熟脑垂体含有的六种不同激素分泌类型的神经元。培养这个垂体要花上约三周的时间，即便培养结束，它也不是一个完整腺体。但是笹井团队把这个部分人造腺体，移植到手术摘除垂体的小鼠大脑中，小鼠产生激素的功能已经可以完全恢复。

笹井团队培育组织的过程看起来简单，实则不然。从小鼠体内获取胚胎干细胞后，直接放入改良96孔板中。每个孔洞有0.3毫升左右的特定类型培养基，包括脑组织、垂体组织和胚眼三种。一旦这些孔板被转移到孵化器中，培育就开始了。

为了将人造组织更好地应用于治疗，团队决定向大规模培育方向发展。“其中一项直接应用就是针对生长激素缺乏患者的细胞移植疗法，” 笹井说道。与此类似的，还有他们正在培育的人造视网膜组织。这种组织也许在未来能治疗黄斑退化和视网膜色素变性这两种致盲性疾病，“我们正在把人造视网膜组织移植到失明动物里，以评估这些组织的功能。”

伦敦大学学院的眼科学家罗宾·阿里（Robin Ali）和同事已经尝试，把年轻小鼠未成熟的视网膜细胞，移植到部分失明的成年动物体内。最近他们发现这些成年动物可以恢复部分视觉功能。他们正在与高桥雅代一起合作，也使用笹井的3D培养法培育视网膜组织。高桥雅代是笹井在理化学研究所CDB的另外一名同事。她同时也计划把视网膜移植到猴子体内。2013年，她开始了一项预实验。为了评估人工视网膜的有效性，她将人诱导多能干细胞产生的视网膜细胞移植到黄斑变性的患者体内。目前，她已开始招募参与实验的人。*

*译者注：该试验结果已在2019年发表。

“再生医学”能创造新生吗

“再生医学”这个词最早出现在1992年的一篇文章中。这篇文章的作者是医疗保健系统未来学派的利兰·恺撒（Leland Kaiser），而再生医学作为其中一段文字的副标题，这段描述了一个“医学的新分支……尝试改变慢性疾病的方向和……重新生长出那些疲劳失效的器官系统”。通过笹井和其他人的研究，这个分支正逐渐冒出萌芽。

然而，并不是所有人都被说服了。“关于‘培育大脑’有很多夸大之词，”蓝斯顿说，“你不可能培育一个大脑。你可以培育出一些有神经元的组织块，但它们的体积不可能比一颗豆子更大了。”

“问题就在于体积，”他继续说道，“你不可能在没有任何血供的情况下，长出一大团组织。一个细胞必须离最近的毛细血管五个细胞直径以内，因为这样它才能存活下去。”正因如此，人造组织的体积绝对不超过几个毫米。想使用笹井的3D培养法长出比胚眼和部分脑垂体更大的组织，这似乎不太可能。

而还有一些人则在质疑将人造器官移植到患者体内这一策略。“虽然人造大脑和眼睛看起来很棒，但我并不认为这是真正的治疗，”克里斯·梅森（Chris Mason）是伦敦大学学院的一名再生医学生物工艺教授，他说道，“为什么要等到患者完全失明了才去做这种大规模治疗呢？我们应该尽早干预，并尽可能减小治疗规模。如果房子起火，你就该立刻扑灭。而不是等到整个房子烧成废墟之后，再重新盖一个房子。”

根据梅森的看法，再生医学真正的潜力在于培养来自患者的细胞。“我认为，最大的价值是我们可以更好地理解疾病，”他说，“你可以从帕金森氏病或者其他运动神经元疾病的患者体内，提取出诱导多能干细胞，再分化出神经元。而我们将有机会从这些神经元中更好地理解疾病进程，从而推动或是逆转进程、或是阻止疾病发生的新药研发。”

但当我与笹井会面时，他却深信他的方法最终可以引领我们发现——他毫不谦虚地称之为——“下下一代”的治疗手段。他希望特定类型的人造神经元可以帮助我们提出新型疗法。无论是像阿兹海默症、帕金森氏病和运动神经元疾病这些神经元退化性疾病，还是休克或其他脑损伤，这种新疗法都可以把它们导致死亡的细胞全部替换为新细胞。

自我排列的生命谜题

2014年8月5日，笹井芳树被发现死于实验室附近。他的死因明显是自杀：这场悲剧与1月的一项干细胞重大发现相关，该论文发表在《自然》之后，对这项发现的质疑不绝于耳，最终论文被撤稿（即小保方晴子事件）。野依良治是日本理化学研究所理事长，他在关于笹井死亡的声明里说，“科学界失去了一位有献身精神并极具天分的研究者，这些年里他所做的开创性研究，值得我们所有人发自内心的尊敬。”在写下本文的时候，一个独立委员会已建议解散CDB。

虽然后来笹井被澄清与这一学术不端事件无关，但是，由于他没有正确地监督指导工作人员，他仍然受到了很多的批评。他在2000年协助建立了CDB，他的团队所取得的成果也让CDB成为一所世界级的研究机构。据说，这一学术事故吞噬了他和他的机构，因此使他感觉“十分羞愧”。

2014年1月那个下雨的早上，笹井和我一起坐在会议室里，他知道他的研究面临着许多挑战，但他对研究的潜能却是坚定又乐观。“我们正在尝试从人胚胎干细胞里培养出神经元，”他说，“但如何更高效地转换仍然存在技术上的问题。我们在试着通过视觉成像来监控移植细胞的活动。”他还预测，五年内人造视网膜可以在人体上测试，而体外培养移植器官将在接下来的十年里逐渐常态化。

但他也说到，他仍然无法解释细胞是怎样自我排列形成如此复杂的结构。“看到那些不需要任何外部推力或影响就出现了的精密结构。这真是令人吃惊。”他告诉我，并把这个比作政治——一种细胞民主。在生长过程中，细胞既影响其他细胞，也被其他细胞所影响；同时不断推动拉扯，抢占空间，争夺生长所需的有限资源。

“自我排列意味着，所有这些过程都是民主调控，”他说，“整个过程完全是自发的。细胞们知道怎么制作一个视杯或者层状皮质。不是我告诉它们怎么做——而是它们相互交流，一起做出决定。”

笹井相信，自我排列只出现在一定规模的群体中。“这种情况仅在大约1000-100000个细胞数量的群体中发生，”他说，“在这个层次，细胞可以直接民主化，不需要被特别长官或者总统指挥。在数百人的小村庄里，人们可以聚在一起，讨论该怎么做，但是一个国家如果没有政府，则会全部乱套。”

“自我排列太神秘了，”他继续说，拘谨的举止已经让步于孩童般的好奇心。“我们仍然不能解释为什么细胞会围在一起变成一只眼睛。一定有更多我们尚未知晓的原理。也正是这点，让我对生命只有敬畏。”

延伸阅读

施佩曼和曼戈尔德的经典试验，证明了后来被称作“施佩曼组织者”的一小块组织，从一个胚胎移植到另一个胚胎之后，可以诱导周围组织形成神经系统。

山中伸弥和同事在2007年发表的一篇关键性文章，证实成人的结缔组织细胞可以恢复到未分化的干细胞样状态，随后经过再编程，形成任意类型的细胞。

安东尼·阿塔拉和同事在2014年报道，他们已给四名少女成功移植了人造阴道。

笹井和同事在2011年发现，ES细胞在3D培养基中可以自我排列，形成有腺体功能的部分脑垂体。

笹井团队在2012年报道，使用同样的培养方法，ES细胞可以形成有视网膜组织的胚眼，里面包含对光敏感的感光细胞。

翻译：Nevaeh；审校：曹安洁

哈特的确诊经历是这种疾病的典型情况。因为ME/CFS包含一些常见疾病的症状，确诊需要排除各种可能的情况，是一个很费功夫的过程。在当时，由于没有血液测试和其他测试手段，医生经常会将这些疑难杂症归为心理问题。像哈特，她的症状就被误认为是抑郁或过劳导致的。

直到今天，ME/CFS都不好分辨。很多时候，这种疾病是由一些单一因素触发的，可能是流感，白细胞增多症，一些外伤，甚至是心理创伤。在接下来的几个月或几年中，就像会像哈特的情况一样，各种症状接踵而来。最常见的症状是持续性疲劳，除此之外还有颈部或腋窝淋巴结增大，短期记忆缺失、注意力不集中、睡眠质量低以及关节疼痛。ME/CFS患者通常都会遇到“直立不耐受”——保持静坐或者静立都会干扰血压，一种影响大脑供血的症状。这种病的患者常常受到体能严重下降的困扰。

患有这种疾病是一种难言之隐。尽管美国有将近两百五十万人受到ME/CFS的困扰，很多人，甚至包括医生在内，都不认为ME/CFS是一种真的生理性疾病。这很可能是由于其极高的确诊难度导致的。虽然现在医生已经有很多种诊断的标准，但是绝大部分还处在争论中。目前，研究人员认为ME/CFS作为临床综合征可能还存在多种亚型，而每一种亚型都需要结合实际情况，用不同的治疗方法应对。

希望的曙光？

但近几年ME/CFS的研究开始有了转机，人们开始意识到ME/CFS患者和健康人的一些生理差别：他们的免疫系统存在异常状况、细胞新陈代谢受损，同时还有一些其他会影响血压和心率的问题。同时，更强大的科技手段也帮助研究ME/CFS的科学家从分子生物学角度更加深入地了解这些问题的本质。与呼吸道、神经免疫等各学科的合作，也给这些科学家带来了新的见解。目前，科学家们的当务之急是找到可用于确诊ME/CFS的生物指标，然后梳理出一套可以有效地将临床综合征分类的机制，将它们归为为几种较为明确的紊乱疾病。

直到不久之前，人们对于究竟是什么引发了劳累后不适（PEM, ME/CFS的一种症状）的情况还了解甚少。ME/CFS的症状常常会在患者用力后加剧，即使是很少的力气——比如去倒杯水——都会导致患者力竭，好几天不能康复。新的研究结果表示，PEM可能是由心肺和神经系统的异常导致的。这项发现离不开波士顿布列根和妇女医院的心肺运动实验室主任大卫·西斯特姆（David Systrom）。他的研究是运用心肺功能测试(iCPET)来跟踪研究PEM。

正常情况下，血液会经过心脏流到肺中获取氧气，再流回到心脏中输往全身细胞。细胞中的线粒体消耗氧气为细胞提供能量。因为运动时氧气消耗量会增大，这些步骤都会进行得更迅速一些，呼吸会更加急促，心跳也会加快。

iCPET收集了患者们这些有关心肺功能的数据。当患者们在高强度运动的时候，这项测试会来检测患者的氧气消耗量、心功能、血压以及血氧饱和度。而研究人员则可以通过这些数据来观察患者与常人的区别。

西斯特姆和同事的这项研究本身处于初步阶段，但他们很快就发现，将这项测试用于检测ME/CFS极为有效。目前，医院确诊的ME/CFS患者都是由这种方式被检测出来的。几乎所有的患者都表现出几种特有的心血管功能紊乱现象。

因为某些原因，这些被确诊为ME/CFS的患者下半身的大静脉不能在运动时有效地收缩，从而导致血液不能有效回流到心脏。西斯特姆把这种情况称之为“加压失败”，通常出现在或坐或站的直立体位。西斯特姆认为该情况很可能和ME/CFS的典型症状“直立不耐受”有关联。也是在这些患者身上，西斯特姆发现他们的肌肉细胞并不能很有效地从血液中汲取氧分。这种情况结合“加压失败”，能很明确地将ME/CFS和其他因为缺乏活动引起的肌肉疾病区分开来。

对于凯蒂·哈特这种被检测出“加压失败”的患者来说，这项客观的指标给他们吃了一颗定心丸。西斯特姆表示：当研究人员通过准确的“硬数据”告诉这些患者他们真的患上某种疾病时，这些患者感觉如释重负。

小纤维神经是罪魁祸首？

以上发现使西斯特姆很快与麻省综合医院的神经学专家安妮（Anne Louise Oaklander）展开合作。安妮是小纤维神经病（SFN）方面的专家, 而这种症状经常出现在ME/CFS的患者身上。二人合作研究了这些“加压失败”的ME/CFS患者是否同时也患有小纤维神经损坏——而结果不出人意料，40%的“加压失败”患者同时患有小纤维神经病。

小纤维神经在全身的神经网络中随处可见，小纤维神经病变可能会使自主神经系统的某些功能失常。安妮和西斯特姆推断，那些出现在ME/CFS患者中的“加压失败”和“供氧不足”，很有可能是由于小纤维神经损坏，自主神经功能失常所导致的。“为了研究该问题，我们正在将生理学和神经解剖学结合起来。”西斯特姆表示。

但现在研究人员还不确定是什么导致了小纤维神经的损坏。一种推测是，因为感染或其他问题所引发的炎症开启了自身免疫系统对小纤维神经的侵袭。我们都知道自体免疫和炎症之间有很多的重叠。在有些自身免疫系统处于特殊状况的病人中，小纤维神经的损坏十分普遍。尤其是在干燥综合征中尤其常见，这种综合征包含的症状是自身免疫系统对泪腺还有唾液腺的攻击。现在，安妮和西斯特姆正在分析一些生物指标，试图从中获得自身免疫系统和小纤维神经损坏间的联系。

寻找治疗方案

尽管小纤维神经损坏背后的生理原因还没有查明，西斯特姆已经着手开始寻找治疗方案。他首先找到的是一种叫溴吡斯的明(pyridostigmine)的药物，这种药物可以用于治疗自身免疫疾病。它的作用机制主要是阻止神经递质乙酰胆碱的分解。由于乙酰胆碱可以改善涉及耐力肌纤维的神经功能，提高它的浓度可以有效解决那些病人肌肉细胞供氧不足的问题。溴吡斯的明同样能有效促进静脉的收缩，帮助更多的静脉血液流回心脏。与此同时，这个药物还具有很好的抗炎性、免疫系统调节作用，尽管西斯特姆并不知道这样的特质是如何产生的。他现在已经通过此药治疗约了300名ME/CFS患者，起到了很好的疗效。目前，这种药已经进入了第三期临床试验阶段。

医学图像也可以帮助科学家们更深刻地了解炎症在ME/CFS中的角色。神经学家迈克（Michael VanElzakker）通过功能磁共振成像分析了患者们静止时和运动时的大脑图像。他的研究重心主要在迷走神经上。迷走神经是自主神经系统中的重要部分，并以乙酰胆碱作为主要的神经递质。迈克希望他的研究能够揭开劳累后不适（ME/CFS的一种症状）与自主神经系统之间的关系。另一项基于正电子层析成像的研究正在探测大脑中的神经是否也有炎症，如果有，这些炎症又具体在哪里。

在另一项研究中，斯坦福医学院的感染病专家何塞·蒙托亚观察发现，ME/CFS患者的核磁共振图像显示他们大脑右侧弓状束（right arcuate fasciculus，连接额叶和颞叶的部分）异常增厚。尽管弓状束的功能目前并不清晰，但研究者们发现，弓状束最厚的患者的症状也是最严重的。图像同时也展示了炎症带来的另一个结果，那就是大脑白质含量异常低。白质的主要作用是在大脑广泛分布的灰质间传递信号。与大脑弓状束的情况相似，白质的异常程度和疾病的严重程度也是成正相关的。

阿拉巴马大学的临床研究者杰里德·杨格（Jarred Younger）通过核磁共振图像发现ME/CFS患者的大脑温度要高于常人，其中最受影响的区域正是用于感知不适、疲劳和沮丧的区域。但是，温度的差别只体现在三分之一的患者中，而他们可能属于神经炎症程度较高的那一类ME/CFS患者。杨格认为，这些患者大脑内的小胶质细胞和免疫细胞可能过度活化，这些细胞会释放一种叫做细胞因子的小蛋白质，而这种小蛋白质可以产生炎症反应并造成一些ME/CFS的症状。

尽管众多假设认为神经炎症是ME/CFS中重要的一环，但并没有人能够指出这种疾病的确切病因。蒙托亚表示，他认为免疫系统的异常是由于病毒感染引起的。他从很多患者身上都检测出了艾巴氏病毒或者人类孢疹病毒。在抗病毒方案治疗下，许多患者的病情都得到了改善甚至痊愈。

杨格认为，对ME/CFS患者应该分类讨论。他将患者分为好几类，有些是由于慢性病菌导致的，有些是由于大脑中免疫反应异常导致的。针对后者，他们大脑中的小胶质细胞很可能受到损伤。小胶质细胞非常敏感，所以很容易就被激活。在这些病人中，一些简单的日常活动都会引发细胞因子的释放。而杨格现在正在研究如何将小胶质细胞重新恢复到静止状态。

蒙托亚和其他科学家也在寻找ME/CFS患者免疫系统中的生物标记物，现在他们正重点研究细胞因子。在一项研究中，蒙托亚的团队在几百个患者和正常人身上测量了51种细胞因子。他的团队发现，17种细胞因子与ME/CFS的严重程度有显著关系，这17种中有13种已确认可引发炎症。细胞因子含量越高，症状越为严重。蒙托亚表示，看到症状和一种生物信号之间的显著关系，非常振奋人心。

由于这种疾病涉及到神经系统、肌肉系统、心血管系统和免疫系统等诸多系统，其复杂程度非常高，为了揭示其诱因和发病机制，研究者们已经花了相当长的时间。ME/CFS让患者深感痛苦，被普罗大众长期忽视。然而，随着这些领域的专家们通力合作，分享研究成果，明确更多细节，ME/CFS的诱因和发病机制正变得更加清晰。研究者下一步需要将这些研究成果结合起来，追本溯源，揭示其真相。

编译：三文鱼；审校：曹安洁，邮狸；编辑：德馨